一、储存条件
温度范围
T4 DNA聚合酶需在-20℃至-15℃的低温条件下保存，部分产品在-20℃环境下可稳定保存2-3年。储存液成分通常包含磷酸钾缓冲液、EDTA、DTT及甘油，以维持酶活性并防止反复冻融导致的降解。
操作规范
避免反复冻融：建议分装后保存，每次取用仅解冻所需量。
运输与临时存放：若需短期运输或临时存放，可使用干冰或-80℃超低温冰箱，并尽量缩短暴露于室温的时间。
二、热失活参数
标准失活条件
T4 DNA聚合酶可通过75℃加热10-20分钟实现失活。
应用场景
终止反应：在DNA平末端制备或标记反应后，需通过热失活终止酶活性，防止过度消化。
兼容性：失活后的酶不会干扰下游实验，但需确保失活条件不破坏DNA模板或产物。
三、反应体系优化
核心反应条件
温度与时间：
平末端制备：12℃反应15分钟，利用3'→5'外切酶活性修饰DNA末端。
高保真合成：37℃反应5分钟，按终浓度1 U/μl加入酶，确保高效掺入脱氧核糖核苷酸。
热调节SLIC克隆：针对短同源片段，50℃处理30秒可提高克隆效率，通过高温破坏DNA二级结构，增强酶与模板的结合。
缓冲液组成：
随酶提供的10×反应缓冲液可优化酶活性。需避免缓冲液污染或ATP降解，必要时补充新鲜ATP。
酶用量调整
标准用量：1μL 10×缓冲液+1μL T4 DNA聚合酶用于1μg DNA的10μL反应体系。
灵活调整：
NGS文库构建：按终浓度1 U/μl加入酶。
低效率反应：可适当增加酶量，但需避免过量导致非特异性结合或产物降解。
DNA底物质量
纯度要求：通过琼脂糖凝胶电泳或磁珠法纯化DNA，去除蛋白质、RNA等杂质，防止抑制酶活性。
末端状态：
平末端：加入5%-10%PEG-8000提高局部DNA浓度，增强连接效率。
粘性末端：确保末端未被核酸外切酶降解，制备后尽快反应或-20℃保存。若怀疑损伤，可用Klenow片段补平。
pH与离子强度
最适pH：7.5-7.8，需定期检查缓冲液pH值，必要时用酸或碱微调。
Mg²⁺浓度：缓冲液中通常含100 mM MgCl₂，过高或过低均会影响酶活性，需严格按说明书配制。
反应体积与操作细节
体积优化：推荐10-20μL反应体系，避免体积过小导致成分不均。
操作规范：使用精密移液器，避免气泡产生；酶切质粒与目的片段摩尔比建议为1:3或1:4，减少假阳性。
更新时间：2025-10-10
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