抗体内化和降解检测技术汇总—助力ADC药物研发

抗体-药物偶联物（Antibody-Drug Conjugate, ADC），其核心设计理念是利用抗体的靶向性，将高细胞毒性的小分子药物（Payload）精准递送至肿瘤细胞内部，从而实现高效杀伤并降低全身毒副作用。然而，一款成功的ADC药物，其疗效绝非简单的“抗体"加“毒素"，关键在于连接子（Linker）稳定性和抗体能否被高效内化（Internalization）并在胞内被及时降解（Degradation）以释放Payload。

 一、 为何内化与降解检测至关重要？

在ADC的作用机制中，内化与降解是承上启下的核心步骤：

1.  内化（Internalization）：ADC与细胞膜表面的靶抗原结合后，通过网格蛋白介导的内吞作用等途径进入细胞，形成内体（Endosome）。
   
   

2.  降解（Degradation）：内体逐渐酸化并成熟为溶酶体（Lysosome），在溶酶体内丰富的蛋白酶和酸性环境下，抗体部分被降解，同时裂解型的连接子断开，释放出游离的有效载荷（Payload），进而发挥杀伤作用。

 二、 核心检测技术汇总

目前，针对内化和降解的检测技术多样，可根据检测原理和目的进行分类应用。

• 基于pH敏感染料的内化效率检测

       原理：pH敏感染料在中性pH环境下无荧光，一旦进入酸性胞内环境（pH<6），荧光强度显著增加。将抗体标记pH敏感型试剂后，其荧光强度与内化程度直接相关。

       优势：背景信号极低，灵敏度高，特别适合高通量筛选（HTS）。

       应用：96或384孔板形式的大规模抗体库初筛。

*信号出现在环境 pH 达到 pKa 之前。

即用型：

• 高敏感性：pH-sensitive IgG labeling reagents 试剂与目的一抗的Fc段快速、定量地结合，形成预复合物。该试剂上已共价连接了pH敏感型染料。无需对一抗进行繁琐的化学偶联，即可实现几乎任何来源的IgG一抗的标记，极大拓宽了应用范围并节省了时间。
  
  

• 操作便捷：试剂与抗体孵育10-20分钟→复合物与细胞孵育→流式检测
  
  

• 低背景：未内化的抗体不会发光，有效避免了膜表面结合抗体对内部化信号的干扰。
  
  

染料：

抗体&蛋白通用：任何在赖氨酸残基上含有伯胺基或半胱氨酸氨残基上含有巯基的蛋白质均可与染料进行偶联。

应用广泛：流式细胞术、荧光显微镜、荧光成像系统和高通量筛选（HCS）

验证数据：

绿色荧光	红色荧光	深红荧光

2、基于细胞杀伤的内化效率检测- DT3C重组蛋白

DT3C是一种重组表达的融合蛋白，与抗体Fc端高度亲和，结合后的DT3C分子在抗体被内吞时一同进入细胞。DT3C释放出具有毒性的DT，阻断蛋白翻译过程，最终导致细胞死亡。

通过MTT, WST-1, UA-Glo细胞活力检测试剂盒(UA070103)等方法，检测细胞活力或细胞死亡情况，从而评估抗体的内化效率。

数据展示：

 3、降解与Payload释放检测技术

1）液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）

原理：目前金标准方法。通过高灵敏度的质谱技术，直接定量检测细胞裂解液中释放出的游离小分子Payload及其代谢产物的绝对含量。

优势：灵敏度（可达皮摩尔甚至飞摩尔级别），可同时进行定性和定量分析，提供最直接的Payload释放证据。

应用：ADC药效评估、连接子稳定性测试、代谢动力学研究。

2）免疫印迹（Western Blot）与免疫沉淀（IP）

原理：利用针对抗体Fc段、独特型（Idiotype）或Payload的特异性抗体，检测细胞裂解液中ADC降解片段或释放的Payload。

优势：可提供降解产物的分子量信息，特异性高。

劣势：半定量，操作繁琐，通量低。

3）报告基因法（Reporter Gene Assay）

原理：构建一种工程细胞系，其Payload（如某种毒素）激活的细胞杀伤效应与一种报告基因（如荧光素酶Luciferase）的活性呈负相关。Payload释放越多，细胞活性越低，报告信号越弱。

优势：功能性地反映Payload的整体生物学效应，通量高。

劣势：是间接检测，易受其他因素干扰。

相关产品推荐：

抗payload抗体

部分验证数据：

报告基因检测试剂盒

三、 技术整合与未来展望

在实际的ADC研发项目中，通常不会依赖单一技术，而是多种技术联用，相互验证。例如：

   初筛阶段：使用pHrodo或流式细胞术进行高通量内化筛选。

   机制验证：采用共聚焦显微镜观察内化路径和溶酶体共定位。

    最终验证：运用LC-MS/MS金标准方法精确量化Payload的释放量和动力学。

抗体的内化与降解是ADC药物发挥“精准杀伤"效应的命门所在。一套成熟、完善且不断创新的内化与降解检测技术体系，如同为ADC研发人员装上了“火眼金睛"，能够穿透细胞膜，洞察内部的运作细节。通过对这些关键过程的深刻理解和精准量化，研究者能够更高效地筛选出最佳候选药物，优化连接子技术，最终加速开发出更安全、更有效的ADC疗法，造福全球癌症患者。