别找我，我在养BMDC

在人体复杂的免疫防御网络中，有一类细胞扮演着"哨兵"与"信使"的核心角色，它们就是树突状细胞。它们时刻监视着机体的异常，一旦发现病原体或癌变细胞，便能迅速激活整个适应性免疫系统，发起精准打击。然而，直接从人体组织中获取树突状细胞不仅困难，而且数量有限，极大地限制了科学研究。于是，科学家们找到了一把解开树突状细胞奥秘的金钥匙------骨髓来源的树突状细胞。

一、 什么是BMDC？

骨髓来源的树突状细胞，并非直接从生物体内分离得到，而是在实验室里通过特定的细胞因子诱导小鼠骨髓前体细胞分化而成的一种细胞模型。

简单来说，其制备过程如下：

1.获取原料：从小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓细胞。

2. 诱导分化：在培养皿中，将这些骨髓细胞与关键的细胞因子------粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子共同培养。

3. 发育成熟：经过数天的培养，这些原本未定型的骨髓前体细胞，就会朝着树突状细胞的方向发育，形成具有典型树突状形态和功能的细胞群体。

虽然BMDC与体内自然存在的树突状细胞在表型和功能上存在一些细微差异，但它们复刻了树突状细胞最核心的功能特征，使其成为免疫学研究中的工具。

二、小鼠BMDC诱导分化protocol

1.小鼠骨髓细胞获取

1.1 将6-8周龄小鼠颈椎脱臼法处死，取股骨，去除骨周围的肌肉组织。

1.2 用75%酒精浸泡消毒股骨2分钟，PBS清洗2次。

1.3 用剪刀剪去股骨两端，用注射器抽取PBS，针头从骨两端插入骨髓腔，反复冲洗直至骨变白。

1.4 收集骨髓悬液，用200目尼龙网过滤。

1.5 滤液1200rpm离心5分钟，弃上清。

1.6 加入2ml 红细胞裂解液，室温裂解3-5分钟。

1.7 加入10ml PBS，1200rpm离心5分钟。

1.8 弃上清，加入PBS清洗1次，用10%FBS的1640培养基重悬细胞。

2. BMDC诱导

2.1 用培养基将细胞密度调整为1e6/mL，同时加入GM-CSF (20ng/mL)和IL-4 (20ng/mL)，此为D0。

2.2 每2天进行半换液，即取出半量培养基，离心收集悬浮细胞，用等体积的培养基重悬，并补充相应浓度的细胞因子后加入皿中。

2.3 D6收集悬浮细胞和贴壁细胞，1200rpm离心5分钟，弃上清将细胞密度调整为1e6/mL，同时加入GM-CSF (20ng/mL)和IL-4 (20ng/mL)，此为未成熟DC（immature DC）。

2.4 BMDC的成熟：在D8加入TNF-α (20ng/mL)，GM-CSF (20ng/mL)和IL-4 (20ng/mL)，D10收集悬浮细胞和贴壁生长的细胞。

3. 不成熟BMDC检测

3.1 收集细胞：细胞因子干预后，弃培养基上清，用PBS清洗细胞1遍，弃上清，再将贴壁细胞用PBS轻轻吹打重悬。

3.2 计数：用细胞计数仪计数并计算细胞总数，并将按照1e7/mL重悬。

3.3 细胞封闭：100μl/孔加至96孔板或流式管中，并加入Mouse IgG (Mouse FcR Blocking Reagent)，4℃孵育30min，300Xg 离心5min，弃上清。

3.4 孵育抗体：各加入以下抗体，4℃孵育30min，300Xg 离心5min，弃上清。

组1：PE anti-mouse CD11c Antibody

APC anti-mouse CD80 Antibody

组2：PE anti-mouse CD11c Antibody

APC anti-mouse CD86 Antibody

3.5 洗涤细胞：用PBS洗涤细胞，去除残留的抗体，并再次用PBS重悬。

3.6 死活染料染色：每孔加入7-AAD，室温避光孵育5min。

3.7 上机检测。

4. 成熟BMDC（mature DC）检测

4.1 收集细胞：细胞因子干预后，弃培养基上清，用PBS清洗细胞1遍，弃上清，再将贴壁细胞用PBS轻轻吹打重悬。

4.2 计数：用细胞计数仪计数并计算细胞总数，并将按照1e7/mL重悬。

4.3 细胞封闭：100μl/孔加至96孔板或流式管中，并加入Mouse IgG (Mouse FcR Blocking Reagent)，4℃孵育30min，300Xg 离心5min，弃上清。

4.4 孵育抗体：各加入以下抗体，4℃孵育30min，300Xg 离心5min，弃上清。

组1：PE anti-mouse CD11c Antibody

APC anti-mouse CD80 Antibody

组2：PE anti-mouse CD11c Antibody

APC anti-mouse CD86 Antibody

4.5 洗涤细胞：用PBS洗涤细胞，去除残留的抗体，并再次用PBS重悬。

4.6 死活染料染色：每孔加入7-AAD，室温避光孵育5min。

4.7 上机检测。

Loosely adherent BM derived cells were harvested and incubated with fluorescently labeled antibodies against various surface antigens.

About 65% cells are induced into DC by GM-CSF only group on Day 6, while ~78% by GM-CSF + IL-4 group. MHC-II+ DC cells is ~7% in GM-CSF group, while ~20% in GM-CSF + IL-4 group.

About 95% cells are induced into DC by GM-CSF only group on Day 10, while ~98% by GM-CSF + IL-4 group. MHC-II+ DC cells is ~14% in GM-CSF group, while ~40% in GM-CSF + IL-4+TNF-α group.

3. BMDC为何如此重要？

BMDC模型的建立，为免疫学、肿瘤学、疫苗开发和药物筛选等领域带来了革命性的便利。

1.稳定且充足的细胞来源

相比于从脾脏或淋巴结中费力分离少量树突状细胞，BMDC技术可以在实验室中轻松获得数以千万计、性状相对均一的细胞，为大规模实验提供了可能。

2. 研究免疫应答的"理想窗口"

科学家可以利用BMDC来直观地研究树突状细胞的"一生"：

抗原摄取：观察BMDC如何吞噬、处理蛋白质抗原或病原体。

成熟活化：研究在何种信号（如炎症因子、病原相关分子模式）刺激下，BMDC会上调主要组织相容性复合体、共刺激分子等，从而完成从"哨兵"到"信使"的转变。

T细胞激活：在共培养实验中，直接观察活化的BMDC如何有效地激活初始T细胞，引发特异性的免疫反应。

3. 肿瘤免疫治疗的研发平台

在癌症免疫治疗领域，BMDC是制备树突状细胞疫苗的核心原料。研究人员可以先用肿瘤抗原在体外"训练"BMDC，再将这群"知情"的BMDC回输到体内，去教育T细胞精准识别并杀伤肿瘤细胞。这种策略为个性化癌症治疗提供了广阔前景。

4. 药物与佐剂的安全性、有效性评估

新型疫苗佐剂或免疫调节药物的效果如何？BMDC是一个的"试金石"。通过观察药物对BMDC成熟和功能的影响，可以快速预测其在体内激活或抑制免疫反应的能力，为后续的动物实验和临床研究提供重要依据。

结语

骨髓来源的树突状细胞，这座连接基础研究与临床应用的桥梁，以其易得、稳定和功能可靠的特点，极大地加速了我们对免疫系统的理解。从揭秘免疫激活的基本原理，到推动创新疗法走向临床，BMDC作为免疫学家的得力助手，将继续在人类对抗感染、癌症和自身免疫疾病的征程中，扮演着不可或替代的关键角色。