一种无需细胞裂解的高通量萤光素酶报告基因检测平台

一、 概述：重新定义报告基因检测的便捷性与数据质量

报告基因检测是研究基因表达调控、信号通路转导及药物筛选的核心实验技术。其中，萤火虫萤光素酶（Firefly Luciferase）因其高灵敏度、宽动态范围和易于检测的特性而被广泛应用。然而，传统的双萤光素酶报告基因检测系统通常需要繁琐的细胞裂解步骤，不仅操作耗时、通量受限，还可能因裂解效率不均一引入实验误差。

UA-Glo® Bio-luc Luciferase Assay System 是一种基于专有工程化萤光素酶（Bio-luc）的革新性检测试剂盒。其核心设计原理是通过对传统萤火虫萤光素酶进行定向改造，使其能够高效地透过细胞膜，并利用细胞自身ATP作为能源，在活细胞或无需裂解的体系中直接催化底物发光。这一设计理念，实现了从"终点裂解检测"到"活细胞实时或终点均质检测"的范式转变。

二、 系统核心原理与组分

该系统通过优化的酶-底物对和检测缓冲液，实现了对胞内萤光素酶活性的直接、定量测量。

核心组分：

工程化萤光素酶（Bio-luc）：该系统并非提供蛋白质，而是通过转染质粒使细胞表达一种经过改造的萤光虫萤光素酶变体。此变体具有增强的胞内稳定性、催化效率，并优化了其与专有底物的反应动力学。

UA-Glo® 检测试剂：为一种即用型、优化的单试剂。该试剂含有经过修饰的萤光素（D-luciferin）底物、表面活性剂及反应缓冲液。其关键特性在于能够高效穿透细胞膜，并维持细胞内环境的稳定性，从而支持酶促反应在胞内进行。

检测原理：

在表达Bio-luc萤光素酶的细胞培养板中，直接加入等体积的UA-Glo® 检测试剂。试剂迅速混匀并穿透细胞膜，胞内的Bio-luc酶立即利用细胞自身产生的ATP和渗透进来的底物，催化氧化反应产生生物发光信号。该光信号强度与细胞内活性萤光素酶的量成正比，从而间接反映目标基因启动子的活性或信号通路的强弱。

三、 工作流程与核心应用

标准化工作流程：

细胞处理与培养：将包含感兴趣启动子/反应元件与下游Bio-luc报告基因的质粒转染至细胞（如HEK293， HeLa等），在96孔或384孔板中培养并进行实验处理（如药物刺激、基因过表达/敲低）。

平衡与加样：将培养板在室温平衡。直接向每孔培养基中加入等体积的UA-Glo® 检测试剂。

振荡与孵育：短暂振荡混匀，室温孵育10-60分钟（时间可优化），以允许信号充分产生并达到稳定平台期。

数据读取：使用兼容的多功能酶标仪或化学发光检测仪读取各孔的发光值（RLU）。

核心应用场景：

基因转录调控研究：定量分析不同启动子、增强子或顺式作用元件的活性。

信号通路功能验证：通过构建通路特异性反应元件驱动的报告基因，研究GPCR、细胞因子受体、激酶等信号分子的激活或抑制。

药物筛选：适用于基于报告基因的高通量药物筛选（HTS），用于发现调节特定通路的小分子化合物、抗体或siRNA。其均质化、无需洗涤的"加样-读值"模式极大提升了通量和效率。

细胞表面受体功能分析：与膜受体激活偶联的报告基因系统结合，研究受体配体的相互作用及下游信号。

四、 相比传统裂解法的技术优势

操作极简：省去裂解、离心、分装裂解液等步骤，实验时间从数小时缩短至数分钟，尤其适合大规模样品筛选。

数据重现性更好：避免了因裂解操作（如裂解时间、振荡强度）不一致导致的孔间变异，提升了实验数据的精确度和重复性。

兼容活细胞与多时间点检测：由于无需裂解，理论上可在同一批细胞上进行多个时间点的动力学监测（需优化以降低底物消耗和细胞毒性影响）。

可直接与其他检测联用：在完成发光检测后，可根据需要，使用其他基于培养基的检测（如细胞活力CCK-8/MTS）对同一孔细胞进行后续分析，实现多重数据获取。

减少废弃物与交叉污染风险：无需开盖转移裂解液，降低了气溶胶产生和样品间交叉污染的可能性。

五、 实验关键注意事项

细胞密度与状态：信号强度高度依赖于细胞自身的ATP水平。需确保细胞处于健康、代谢活跃的状态，并优化铺板密度以获得信噪比。

培养基兼容性：虽然系统对含血清或双抗的常见培养基兼容性良好，但某些特殊成分（如高浓度抗氧化剂、影响膜通透性的化合物）可能干扰检测，建议进行预实验验证。

检测窗口期：发光信号通常在加样后10-30分钟达到高峰并稳定一段时间。需确定适用于自身实验体系的读值时间点。

背景控制：必须设置未转染报告基因质粒的阴性对照孔，以扣除细胞和培养基自身的本底发光。

六、 总结

UA-Glo® Bio-luc Luciferase Assay System 代表了报告基因检测技术向更高效、更可靠方向演进的重要一步。它通过巧妙的酶工程与试剂配方设计，将复杂的胞内酶活性检测转化为一步完成的均质化操作。

其核心价值在于：

解放人力，提升效率：为高通量功能基因组学和药物筛选研究提供了理想的工具。

提升数据质量：通过标准化、自动化的加样流程，减少了人为操作误差，增强了结果的可靠性。

拓展实验可能性：其非破坏性特点为活细胞动态监测和多重检测联用提供了新的思路。

对于从事转录调控、信号通路研究及药物早期发现的科研与工业界人员而言，该系统是一个能够显著优化工作流程、加速研究进程的强大工具平台。