T细胞来源确认：
外周血单个核细胞（PBMC）需新鲜分离（采血后6小时内处理），活细胞率≥95%；
冷冻保存的T细胞复苏后，需经流式细胞术检测CD3+细胞比例（目标值≥85%）。
无菌操作规范：
实验全程在生物安全柜内进行，台面用75%乙醇消毒，紫外照射30分钟；
操作人员穿戴无菌手套、口罩，避免交叉污染。
T细胞激活试剂盒的操作流程
（一）激活体系配制
抗体包被步骤：
用PBS稀释CD3抗体至5μg/ml，每孔加入50μl，4℃包被过夜或37℃孵育2小时；
弃去包被液，用PBS洗涤3次，去除未结合抗体（每次洗涤后离心5分钟，200g）。
细胞重悬与刺激：
将T细胞调整至1×10⁶cells/ml，加入含10%FBS的RPMI1640培养基；
每孔加入100μl细胞悬液，再添加CD28抗体（终浓度1μg/ml）及IL-2（50U/ml），37℃培养。
（二）培养与监测
培养条件控制：
每24小时观察细胞形态（正常激活细胞呈圆形或短梭形，聚集成簇）；
每3天半量换液（弃去50%上清，补充新鲜培养基），维持IL-2浓度。
活性与增殖检测：
MTT法：培养第5天每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），4小时后溶解甲瓒，测定OD₅₇₀值；
流式细胞术：标记CD25、CD69等激活标志物，评估激活效率（目标激活率≥80%）。
（三）终止培养与下游应用
细胞收获：
离心收集细胞（300g，5分钟），用PBS洗涤2次，去除残留抗体；
用于CAR-T制备时，需确保细胞活率≥90%，细胞浓度1×10⁷cells/ml。
数据记录：
记录细胞形态、增殖曲线、激活标志物表达等数据，绘制趋势图；
异常结果（如激活率＜60%）需分析原因（如抗体浓度不足、污染等）。
更新时间：2025-07-01
点击次数：13
当前位置：
上一个：
返回列表
