GFP重组,GFP His Tag protein, Aequorea victoria。GFP重组使用DNA连接酶，将目的基因、GFP基因按照一定顺序（通常是目的基因在前，GFP在后，或反之，需根据蛋白结构设计）连接到载体中，形成“目的基因-GFP融合基因表达载体"。

The green fluorescent protein （GFP） is a protein that exhibit bright green fluorescence when exposed to blue light. It is a widely used reporter in gene expression and protein localization studies. the green fluorescent protein （GFP） from the jellyfish Aequorea victoria is a widely used reporter in studies of gene expression and protein localization. GFP is a single chain polypeptide of 238 amino acids .Most of these amino acids form β sheets that are compacted through an antiparallel structure to form the barrel. So far, they have been used as reporters of gene expression, tracers of cell lineage, and as fusion tags to monitor protein localization within living cells.
 

GFP重组的步骤遵循基因工程的基本框架，具体可分为以下6步：  

1.目的基因与GFP基因的获取  

目的基因：通过PCR扩增从生物体基因组中获取，或从基因文库中筛选。  

GFP基因：可直接使用野生型GFP基因，或经过优化的突变体（如增强型EGFP，荧光强度更高、更稳定）。  

2.载体的选择与制备  

载体是携带基因进入宿主细胞的“工具”，常用的有质粒（适用于细菌、酵母、哺乳动物细胞）、病毒载体（如腺病毒，适用于动物活体）等。  

载体需经过酶切处理，使其两端产生与目的基因、GFP基因匹配的粘性末端，便于后续连接。  

3.基因连接：构建融合基因表达载体  

使用DNA连接酶，将目的基因、GFP基因按照一定顺序（通常是目的基因在前，GFP在后，或反之，需根据蛋白结构设计）连接到载体中，形成“目的基因-GFP融合基因表达载体”。  

关键：确保融合基因的阅读框（ORF）正确，否则会导致蛋白合成异常，失去荧光活性。  

4.转化/转染：将重组载体导入宿主细胞  

转化：针对细菌、酵母等微生物，通过化学处理（如氯化钙法）或电穿孔法让细胞吸收载体。  

转染：针对动物细胞，常用脂质体介导、病毒介导或显微注射等方法。  

5.筛选与鉴定：获得阳性克隆  

载体通常携带筛选标记（如抗生素抗性基因），通过抗性筛选可初步获得成功导入载体的细胞。  

进一步通过PCR、测序等方法验证融合基因是否正确插入，确保重组载体构建无误。  

6.表达与荧光检测  

诱导宿主细胞表达融合蛋白（如通过IPTG诱导细菌表达，或利用载体自带的启动子在特定条件下启动表达）。  

使用荧光显微镜、流式细胞仪等设备，在蓝光激发下观察绿色荧光，验证融合蛋白是否成功表达及定位。  

GFP重组的优势与注意事项  

优势：  

非侵入性：无需破坏细胞或组织，可活体、实时观察。  

高特异性：仅标记目标分子，信号干扰少。  

操作灵活：可与多种基因、载体结合，适配原核到真核的多种宿主。  

注意事项：  

可能影响目的蛋白功能：GFP分子量约27kD，若与小分子蛋白融合，可能改变其空间结构，导致功能异常（需通过预实验验证）。  

荧光淬灭：长时间激发可能导致GFP荧光减弱，需控制观测时间或使用抗淬灭试剂。  

启动子选择：需根据宿主细胞类型选择合适的启动子（如原核生物用lac启动子，哺乳动物细胞用CMV启动子），确保GFP正常表达。